熒光顯微鏡的原理
點(diǎn)擊次數:1269 更新時(shí)間:2017-11-28
熒光顯微鏡的原理
熒光顯微鏡是用人眼不可見(jiàn)的一定波長(cháng)的紫外線(xiàn)作光源照射被檢物體,使之受激發(fā)后而產(chǎn)生人眼可見(jiàn)的熒光,然后再經(jīng)顯微鏡成像系統放大來(lái)進(jìn)行鏡檢。熒光顯微術(shù)是生物,醫學(xué)中的重要研究手段,如對生物組織、生理、病理、微生物、醫藥、食品、化學(xué)等諸方面的鑒定等。
一、熒光
普通光是由發(fā)光體質(zhì)點(diǎn)的熱運動(dòng)所引起的輻射;而熒光是非溫度輻射,是一種冷光。熒光有多種,如光化熒光(由光源激發(fā)而產(chǎn)生的熒光),放射出熒光(由放射性物質(zhì)激發(fā)而產(chǎn)生的熒光)。生物熒光(如磷的氧化時(shí)發(fā)出的熒光),等等。而熒光顯微鏡則是利用光化熒光這原理設計制造,達到熒光顯微術(shù)鏡檢的目的。
由于熒光顯微鏡的光源是利用人眼不可見(jiàn)的短波光,因而就大大提高了物鏡的分辨率,圖像與背景的反差亦甚為明顯。
二、熒光現象
將熒光物體放到光譜中的各色區域,就可發(fā)現引起熒光zui有效的光線(xiàn)是光譜上波長(cháng)較短的區域,即近紫外線(xiàn)區域,波長(cháng)約為320-400nm。這種現象的實(shí)質(zhì)是分子吸收了短光的能量(波長(cháng)越短,光能越強),又以發(fā)光的形式以波長(cháng)較長(cháng)和熒光射出,而為人眼可見(jiàn),這就是熒光現象。熒光接近可見(jiàn)光的紅光端,大部分的熒光現象是符合這一規律的。
熒光現象可分為兩種:
1. *次熒光現象;又稱(chēng)固有熒光或自發(fā)熒光,當經(jīng)紫外線(xiàn)的照射后,就能發(fā)出熒光的物質(zhì);
2. 第二次熒光現象:又稱(chēng)激發(fā)熒光,當經(jīng)紫外線(xiàn)照射后不能或只部分發(fā)生微弱的熒光,這樣就需先用熒光素處理,再經(jīng)紫外線(xiàn)照射才能發(fā)生熒光,這是因組織內吸附或溶解有熒光素的緣故。
三、熒光顯微鏡的原理
濾色塊是熒光顯微鏡的重要部位,其核心部件由激發(fā)光濾色片(first barrier filter)、發(fā)射光濾色片(second barrier filter)和半透半反濾色片(beam-splitting mirror)組成。
1.激發(fā)光濾色片及發(fā)射光濾色片:根據光源和熒光色素的特點(diǎn),通常選用以下三類(lèi)配套,提供一定波長(cháng)范圍的激發(fā)光,并使樣品激發(fā)出的熒光透過(guò),到達目鏡成像。
紫外光激發(fā):激發(fā)光濾色片可使紫外光透過(guò),阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。與之相應的發(fā)射光濾色片可允許藍光通過(guò),視野內的光呈藍色,如應用于DAPI染色。
藍光激發(fā):激發(fā)光濾色片可使藍光通過(guò),阻擋其他波段的光。與之相應的發(fā)射光濾色片可允許綠光通過(guò),如GFP 染色標記。
綠光激發(fā):激發(fā)光濾色片使綠光通過(guò),阻擋其他波段的光。與之相應的發(fā)射光濾色片通??稍试S紅光通過(guò),如Rhodamine染色。
2.半透半反濾色片:它的作用是*阻擋激發(fā)光通過(guò),而將其反射;并透過(guò)相應波長(cháng)范圍的發(fā)射光。其型號與激發(fā)光濾色片和發(fā)射光濾色片相對應。
3. 光路:光線(xiàn)在熒光濾色塊中的傳播光路為:反射光濾光片只允許光源中特定波長(cháng)的光線(xiàn)透過(guò),這部分激發(fā)光到達半透半返濾色片時(shí)被反射后通過(guò)物鏡照射到樣品上,樣品中的熒光基團被激發(fā)光激發(fā),發(fā)射出長(cháng)波長(cháng)的熒光;發(fā)射光通過(guò)物鏡,透過(guò)半透半反濾色片,到達發(fā)射光濾色片,此時(shí)又只有特定波長(cháng)的光線(xiàn)透過(guò),zui后通過(guò)目鏡被我們肉眼看到的就是樣品中的熒光了。